Aktywacja neuronów serotoninowych po odstawieniu paroksetyny

Czy nagłe odstawienie SSRI aktywuje specyficzne obwody neuronalne związane z lękiem?

Selektywne inhibitory wychwytu zwrotnego serotoniny (SSRI) stanowią terapię pierwszego rzutu w leczeniu depresji i zaburzeń lękowych, jednak ich nagłe odstawienie może prowadzić do wyniszczającego zespołu odstawiennego. Objawy – w tym nasilenie lęku, zaburzenia snu i dysfunkcje sensoryczne – pojawiają się w ciągu kilku dni od zaprzestania terapii i mogą utrzymywać się przez tygodnie, a w niektórych przypadkach nawet dłużej. Dotychczas mechanizmy neuronalne odpowiedzialne za te objawy pozostawały nieznane, zarówno w modelach zwierzęcych, jak i u ludzi.

Badania przedkliniczne wskazują, że dyskontynuacja SSRI wywołuje u gryzoni szereg zmian behawioralnych przypominających objawy kliniczne. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że odstawienie citalopromu u szczurów zwiększało reakcję na bodziec akustyczny (interpretowaną jako stan nadpobudliwości i lęku), podczas gdy u myszy zaprzestanie podawania paroksetyny lub citalopromu nasilało zachowania lękowe w teście uniesionego labiryntu krzyżowego (EPM). Co istotne, efekt ten był wykrywalny po 2, ale nie po 5 dniach od dyskontynuacji, sugerując krótkotrwały wpływ na zachowania związane z lękiem.

Ekspresja genu wczesnej odpowiedzi komórkowej c-fos – wykorzystywana w badaniach immunohistochemicznych jako marker aktywności neuronalnej – pozwala na identyfikację obwodów nerwowych aktywowanych przez sytuacje i bodźce wywołujące lęk. Eksperymenty z zastosowaniem leków anksjogennych oraz ekspozycją na nowe, stresujące środowiska wykazały zwiększoną immunoreaktywność c-Fos w hipokampie brzusznym, jądrze przykomorowym podwzgórza (PVN), jądrze podstawno-bocznym ciała migdałowatego (BLA), korze przedczołowej (PFC) oraz istocie szarej okołowodociągowej (PAG). Istotne jest również, że regiony te otrzymują bogate unerwienie serotoninowe z jąder szwu – głównego źródła serotoniny (5-HT) w mózgu.

Ostatnie doniesienia sugerują, że dyskontynuacja SSRI może wiązać się z aktywacją neuronów serotoninowych; badania neurochemiczne wykazały wzrost poziomu tkankowego 5-HT i jego metabolitu 5-HIAA w hipokampie i innych strukturach mózgu po odstawieniu SSRI. Rzeczywiście, niedawno zaobserwowano zwiększoną immunoreaktywność c-Fos w grzbietowym jądrze szwu (DRN) u myszy po dyskontynuacji paroksetyny. Pozostaje jednak niejasne, jaki jest dalszy efekt takiej aktywacji serotoninowej na struktury mózgu związane z lękiem.

Jakie regiony mózgu ulegają aktywacji po odstawieniu paroksetyny?

W prezentowanym badaniu naukowcy z University of Oxford i University of Leicester zbadali wpływ dyskontynuacji paroksetyny na ekspresję c-Fos w szeregu struktur śródmózgowia i przodomózgowia powiązanych z obwodami lękowymi. Szczególną uwagę poświęcono szczegółowej analizie neuronów w podregionach DRN i jądra szwu pośrodkowego (MRN), zwłaszcza tych immunopozytywnych dla markera serotoniny – hydroksylazy tryptofanowej 2 (TPH2). Dodatkowo przeanalizowano neurony współekspresujące TPH2 i pęcherzykowy transporter glutaminianu VGLUT3, które współuwalniają serotoninę i glutaminian – populację ostatnio powiązaną z zachowaniami lękowymi i reakcjami stresowymi.

Samce myszy C57BL/6J (n=12/grupa) otrzymywały paroksetynę (10 mg/kg s.c.) lub sól fizjologiczną raz dziennie przez 12 dni, a następnie kontynuowano leczenie lub zamieniono na iniekcje soli fizjologicznej przez kolejne 2 lub 5 dni. Punkty czasowe wybrano na podstawie wcześniejszych eksperymentów pokazujących, że nasilone zachowania lękowe w EPM były widoczne 2 dni po dyskontynuacji paroksetyny, ale nie po 5 dniach. Po ekspozycji na EPM (5 minut) pobierano tkanki mózgowe i przeprowadzano immunohistochemię z oznaczeniem c-Fos, TPH2 oraz VGLUT3.

Czy dyskontynuacja paroksetyny aktywuje neurony serotoninowe w DRN?

Kluczowym odkryciem było to, że dyskontynuacja paroksetyny zwiększyła liczbę neuronów podwójnie znakowanych c-Fos/TPH2 w grzbietowym DRN w porównaniu zarówno z grupą otrzymującą ciągłą paroksetynę, jak i kontrolą solankową (główny efekt leczenia: F(2,30)=23,55, p<0,0001; post-hoc: SAL vs DIS p=0,0002, CON vs DIS p<0,0001). Efekt ten był wykrywalny niezależnie od dnia dyskontynuacji, co oznacza, że utrzymywał się zarówno po 2, jak i 5 dniach od zaprzestania terapii.

W brzusznym DRN dyskontynuacja również zwiększyła ogólną liczbę neuronów c-Fos-immunoreaktywnych oraz liczbę neuronów podwójnie znakowanych c-Fos/TPH2 w porównaniu z grupą otrzymującą ciągłą paroksetynę (F(2,31)=5,440, p=0,0094; post-hoc CON vs DIS p=0,0090). Obserwowano trend w kierunku wzrostu względem kontroli solankowej (p=0,0894), chociaż bez istotnej interakcji leczenie×dzień.

W przeciwieństwie do DRN, w MRN dyskontynuacja paroksetyny nie zwiększyła liczby neuronów c-Fos/TPH2 powyżej poziomu kontrolnego, choć testy post-hoc wykazały ich większą liczbę w grupie dyskontynuacyjnej niż w grupie otrzymującej ciągłą paroksetynę (F(2,30)=7,645, p=0,0021; post-hoc CON vs DIS p=0,0015). Co istotne, ciągłe podawanie paroksetyny obniżyło liczbę neuronów c-Fos-immunoreaktywnych w MRN w porównaniu z kontrolą, a ekspresja c-Fos powróciła do poziomu kontrolnego po dyskontynuacji.

Ogólnie rzecz biorąc, efekt dyskontynuacji był specyficzny dla neuronów serotoninowych, ponieważ nie zaobserwowano istotnego wzrostu ekspresji c-Fos w neuronach TPH2-immunonegatywnych (nieserotoninowych). Wyniki te potwierdzają wcześniejsze doniesienia, że zaprzestanie podawania SSRI prowadzi do odbicia wzrostowego syntezy, metabolizmu i uwalniania 5-HT w strukturach przodomózgowia, w tym hipokampa. Taki efekt może wynikać z nagłego uwolnienia od hamowania autoreceptorowego serotoniny, które prawdopodobnie jest obecne przy ciągłej ekspozycji na SSRI.

Czy aktywowane są także neurony współuwalniające serotoninę i glutaminian?

Dalsze badania immunohistochemiczne z zastosowaniem znacznika VGLUT3 – markera współuwalniania glutaminianu przez neurony serotoninowe – ujawniły, że większość neuronów podwójnie znakowanych VGLUT3/TPH2 znajduje się w brzusznym DRN, z rzadkim znakowaniem w innych podregionach DRN czy MRN, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami. Co istotne, immunobarwienie wykazało również neurony potrójnie znakowane c-Fos/TPH2/VGLUT3.

Dyskontynuacja paroksetyny zwiększyła liczbę neuronów potrójnie znakowanych c-Fos/VGLUT3/TPH2 (jako proporcję całkowitej liczby neuronów VGLUT3/TPH2) w brzusznym DRN (główny efekt leczenia: F(2,31)=3,883, p=0,0313; post-hoc CON vs DIS p=0,0245). Efekt ten był szczególnie widoczny po 2 dniach dyskontynuacji w porównaniu zarówno z ciągłą paroksetyną, jak i kontrolą solankową, ale nie utrzymywał się do 5. dnia. Z drugiej strony, dyskontynuacja zwiększyła ekspresję c-Fos w neuronach TPH2-immunopozytywnych, ale VGLUT3-immunonegatywnych w brzusznym DRN, przy czym efekt ten nie różnił się między dniami dyskontynuacji (F(2,30)=10,74, p=0,0003).

Interesującym odkryciem było to, że ciągłe podawanie paroksetyny spowodowało niewielkie zmniejszenie liczby neuronów współekspresujących TPH2 i VGLUT3 w porównaniu z kontrolą solankową (jako proporcji całkowitej liczby neuronów TPH2), które następnie znacząco spadło po dyskontynuacji (F(2,30)=4,509, p=0,0194; post-hoc SAL vs DIS p=0,0160). Sugeruje to, że ekspresja VGLUT3 uległa obniżeniu po dyskontynuacji paroksetyny, co mogłoby przesunąć równowagę współuwalniania serotoniny i glutaminianu w kierunku serotoniny.

Jakie zmiany zachodzą w hipokampie po odstawieniu paroksetyny?

Kolejnym krokiem było zbadanie wpływu dyskontynuacji paroksetyny na ekspresję c-Fos w hipokampie brzusznym – regionie związanym z zachowaniami lękowymi u gryzoni, który otrzymuje znaczące unerwienie serotoninowe. Dyskontynuacja paroksetyny zwiększyła liczbę neuronów c-Fos-immunoreaktywnych w zakręcie zębatym hipokampa brzusznego po 2 dniach, ale nie po 5 dniach, w porównaniu z kontrolą solankową (główny efekt leczenia: F(2,31)=3,527, p=0,0417; post-hoc SAL vs DIS p=0,0477; efekt dnia: F(1,31)=20,14, p<0,0001; interakcja: F(2,31)=5,744, p=0,0075).

Nie zaobserwowano efektu leczenia na ekspresję c-Fos w podregionie CA3 hipokampa brzusznego ani w zakręcie zębatym czy CA3 hipokampa grzbietowego. Zatem dwudniowa dyskontynuacja paroksetyny wiązała się ze wzrostem liczby neuronów c-Fos-immunoreaktywnych w hipokampie brzusznym, ale nie grzbietowym. Aktywacja hipokampa brzusznego może przyczyniać się do efektu anksjogennego dyskontynuacji paroksetyny, ponieważ istnieje dobrze ugruntowany związek między tym regionem a lękiem, a jego aktywność promuje hamowanie behawioralne.

Podobnie jak w przypadku DRN, sytuacje wywołujące lęk zwiększają ekspresję c-Fos w hipokampie brzusznym, a farmakologiczna aktywacja tego regionu nasilała zachowania lękowe w EPM. Co więcej, ekspresja c-Fos w hipokampie brzusznym wzrosła po 2, ale nie po 5 dniach dyskontynuacji, co odpowiada czasowemu profilowi zachowań lękowych, dostarczając dodatkowego powiązania ze stanem lękowym. Chociaż powszechnie uważa się, że główna projekcja serotoninowa do hipokampa brzusznego pochodzi z MRN, istnieje również unerwienie serotoninowe z DRN. Możliwe zatem, że odpowiedź c-Fos w hipokampie na dyskontynuację jest konsekwencją aktywacji neuronów serotoninowych DRN.

Czy dyskontynuacja paroksetyny wpływa na inne struktury związane z lękiem?

Zaskakująco, poza DRN i hipokampem brzusznym, inne regiony mózgu, które przewidywano jako potencjalnie aktywowane przez stan lękowy, nie wykazały zwiększonej ekspresji c-Fos w odpowiedzi na dyskontynuację paroksetyny. Obejmowało to MRN (które jest związane z mechanizmami lęku), podregiony kory przedczołowej (ACC, PLC, OFC), BLA, PVN oraz PAG – wszystkie te struktury są powiązane z lękiem i typowo wykazują zwiększoną immunoreaktywność c-Fos w odpowiedzi na leki anksjogenne i inne bodźce wywołujące lęk.

W korze preelimbicznej (PLC) ciągłe podawanie paroksetyny zmniejszyło ekspresję c-Fos w porównaniu z kontrolą solankową, ale dyskontynuacja paroksetyny nie różniła się istotnie od ciągłej paroksetyny ani kontroli solankowej (F(2,31)=3,554, p=0,0408; post-hoc CON vs DIS p=0,0445). Nie było efektów dyskontynuacji paroksetyny na liczbę neuronów c-Fos-immunoreaktywnych w ACC, OFC, BLA, PVN czy PAG.

Jednym z wyjaśnień ograniczonej liczby regionów mózgu wykazujących odpowiedź c-Fos na dyskontynuację paroksetyny może być to, że przed pobraniem tkanki mózgowej myszy były eksponowane na EPM. To doświadczenie samo w sobie mogło zwiększyć ekspresję c-Fos w niektórych regionach związanych z lękiem do tego stopnia, że dalsze zwiększenie byłoby niewykrywalne (efekt sufitowy). Aby ocenić tę możliwość, przeprowadzono dodatkowe eksperymenty na naiwnych myszach, które wykazały, że ekspozycja na EPM (w obecnych warunkach) zwiększyła ekspresję c-Fos tylko w hipokampie (zarówno grzbietowym, jak i brzusznym), ale nie w DRN, MRN, PLC czy BLA.

Bardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem jest to, że efekty dyskontynuacji paroksetyny na obwody lękowe były ograniczone pod względem wielkości i charakteru ze względu na wcześniejsze umieszczenie na EPM. Tak więc niezmieniona ekspresja c-Fos w BLA może odzwierciedlać rolę tego regionu w aktywnym unikaniu (np. ukierunkowanych reakcjach ucieczki) i warunkowym lub wyuczonym lęku, które nie są oceniane w EPM badającym lęk niewarunkowy. Podobnie brak zmiany ekspresji c-Fos w PFC może odzwierciedlać fakt, że wykonanie EPM nie angażuje mechanizmów kontroli behawioralnej opartych na wcześniejszej wiedzy i doświadczeniach, które zapewnia ten region.

Co te odkrycia oznaczają dla zrozumienia zespołu odstawiennego SSRI?

Obecne badanie wykazało, że dwudniowa dyskontynuacja paroksetyny aktywowała neurony serotoninowe w DRN, w tym neurony współuwalniające serotoninę i glutaminian, a także neurony w hipokampie brzusznym. Te odkrycia wspierają hipotezę rozwiniętą na podstawie wcześniejszych badań behawioralnych i neurochemicznych, że efekty behawioralne dyskontynuacji SSRI są związane z aktywacją specyficznych obwodów promujących lęk. Chociaż w obecnych warunkach efekty te były ograniczone do neuronów serotoninowych DRN i hipokampa, te obwody mogą przyczyniać się do objawów takich jak nasilony lęk, które stanowią część zespołu odstawiennego SSRI u pacjentów.

Istnieje kilka linii dowodów sugerujących, że może istnieć związek przyczynowy między aktywacją neuronów serotoninowych DRN wywołaną dyskontynuacją a nasilonym lękiem. Po pierwsze, ten sam dwudniowy protokół dyskontynuacji paroksetyny, który tutaj zwiększył liczbę neuronów podwójnie znakowanych c-Fos/TPH2, wcześniej wykazano, że zwiększa zachowania lękowe w EPM. Po drugie, wcześniejsze badania wykazały, że podawanie leków anksjogennych wywoływało ekspresję c-Fos w DRN. Po trzecie, badania elektrofizjologiczne in vivo wykazały, że ekspozycja myszy na bodziec anksjogenny zwiększa wyładowania neuronów serotoninowych DRN. Wreszcie, aktywacja optogenetyczna i chemogenetyczna neuronów serotoninowych DRN i ich projekcji do przodomózgowia wywoływała zależne od receptorów serotoninowych zwiększenie zachowań lękowych, w tym w EPM.

Warto jednak zauważyć, że podczas gdy pięć dni dyskontynuacji paroksetyny zwiększyło liczbę neuronów podwójnie znakowanych c-Fos/TPH2 w DRN, to samo leczenie nie wywoływało zachowań lękowych w EPM. Sugeruje to, że aktywacja neuronów serotoninowych DRN wywołana dyskontynuacją może sama w sobie nie być wystarczająca do wywołania lęku. Możliwe jest również, że zwiększona aktywność neuronów współuwalniających serotoninę i glutaminian przyczynia się do efektów behawioralnych dyskontynuacji – podobnie jak dyskontynuacja paroksetyny, ostry stres pływacki zwiększał ekspresję c-Fos w neuronach DRN, które kolokalizowały VGLUT3 i TPH2.