Fotofarmakologia w terapii zaburzeń psychicznych – przełom w leczeniu depresji

Czy fotofarmakologia zmieni oblicze terapii neuropsychiatrycznych?

Fotofarmakologia otwiera nowe możliwości w leczeniu zaburzeń psychicznych. Naukowcy opracowali innowacyjny związek – azo-paroksetynę, który może być aktywowany światłem, umożliwiając precyzyjną kontrolę nad działaniem leku. Badania wykazały, że modyfikacja paroksetyny poprzez dodanie grupy azobenzenu tworzy cząsteczkę, której aktywność można regulować za pomocą światła o określonej długości fali.

Transportery neuroprzekaźników (NTT) odgrywają kluczową rolę w regulacji dostępności neuroprzekaźników w przestrzeni synaptycznej. Transporter serotoniny (SERT) jest głównym celem leków przeciwdepresyjnych, ponieważ dysfunkcja układu serotoninergicznego wiąże się z licznymi zaburzeniami afektywnymi, takimi jak lęk i depresja. Aktualne leki przeciwdepresyjne często wykazują efekty uboczne i zmniejszoną skuteczność kliniczną u części pacjentów, co podkreśla potrzebę opracowania nowych, bardziej selektywnych związków oddziałujących z SERT.

Fotofarmakologia wykorzystuje małe cząsteczki, które można aktywować światłem w sposób odwracalny poprzez dołączenie grup fotochromowych, najczęściej azobenzenu. “Uzyskana precyzja czasowo-przestrzenna może być wykorzystana do badania procesów dynamicznych w wybranych tkankach i pozwala na zmniejszenie efektów ubocznych, co ostatecznie poprawia profil farmakologiczny danego leku” – piszą autorzy badania. W ostatnich latach opracowano pierwsze przełączalne związki fotofarmakologiczne, które oddziałują z transporterami neuroprzekaźników, w tym z transporterem kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) (GAT1), glutaminianu (EAAT1-3), a ostatnio także z SERT.

Jak zaprojektowano i zsyntetyzowano azo-paroksetynę?

Autorzy badania zaprojektowali i zsyntetyzowali fotoprzełączalny analog paroksetyny nazwany azo-paroksetyną. Paroksetyna jest inhibitorem SERT o wysokim powinowactwie, stosowanym jako lek przeciwdepresyjny, który jest wysoce selektywny wobec transportera dopaminy (DAT) i transportera norepinefryny (NET). Badacze wykorzystali niedawno opublikowaną strukturę krystaliczną ludzkiego SERT w kompleksie z paroksetyną jako doskonały punkt wyjścia do zaprojektowania fotoprzełączalnego ligandu SERT. Paroksetyna wiąże się do miejsca ortostatycznego w SERT, a jej fragment fluorofenylowy znajduje się w podjednostce C z dostępem do przedsionka zewnątrzkomórkowego, co umożliwia wprowadzenie fotoprzełączalnej grupy do szkieletu paroksetyny.

Synteza azo-paroksetyny obejmowała osiem etapów, w których grupę fotoprzełączalną wprowadzono do cząsteczki paroksetyny poprzez zastąpienie oryginalnej grupy fluorofenylowej. Proces rozpoczynał się od kwasu 4-nitrocynamowego, który przekształcono w odpowiedni amid przy użyciu benzyloaminy. Amid α-nienasycony uległ cyklizacji z akrylanem metylu poprzez podwójne przyłączenie Michaela. Niepożądany cis-piperydynon został epimeryzowany w celu uzyskania większych ilości pożądanego produktu trans. W kolejnym etapie zarówno funkcja estrowa, jak i laktam zostały zredukowane przy użyciu NaBH₄ i BF₃ w refluksującym THF, pozostawiając nienaruszoną grupę nitrową. Racemiczny alkohol został wykorzystany do enzymatycznego rozdzielenia kinetycznego poprzez acetylację katalizowaną przez lipazę. Alkohol (3S,4R) został pomyślnie wyizolowany z nadmiarem enancjomerycznym wynoszącym 99%. Następnie przeprowadzono eteryfikację z sesamolem i redukcję wodorem i Pd(C), co dało pożądany analog aniliny paroksetyny. Ostatecznie azo-paroksetyna powstała w wyniku kondensacji z nitrozobenzenem.

Czy właściwości fotofizyczne i farmakologiczne spełniają oczekiwania?

Po syntezie naukowcy scharakteryzowali właściwości fotofizyczne azo-paroksetyny. Spektrum związku adaptowanego w ciemności (stan E) wykazywało cechy oczekiwane dla pochodnej trans-azo. Przy naświetlaniu światłem niebieskim (intensywność 600 mW/cm², λ 365 nm) zaobserwowano wyraźną zmianę wskazującą na izomeryzację E/Z. Dodatkowo przeprowadzono pomiary ilościowe z wykorzystaniem UHPLC-TOF-MS w celu określenia wydajności izomeryzacji. Próbki azo-paroksetyny o stężeniu 10 μM przygotowano w czterech różnych rozpuszczalnikach, aby zbadać różnice w zachowaniu przełączania między DMSO a układami wodnymi. Uzyskano bardzo dobre przełączanie dla azo-paroksetyny w porównaniu z innymi strukturami azobenzenu, osiągając stany fotostacjonarne 83-87% izomeru Z po naświetlaniu. Tak wysoki stopień przełączalności jest kluczowy dla wyraźnych różnic w biologicznych testach hamowania wychwytu między naświetlanymi a nienaświetlanymi próbkami.

Następnie badacze sprawdzili, czy izomer E i równowaga fotostacjonarna E/Z azo-paroksetyny mogą oddziaływać z ludzkim SERT stabilnie ekspresjonowanym w komórkach HEK293. Oba stany (ciemny i PSS przy 365 nm) hamowały wychwyt znakowanej trytem serotoniny w sposób zależny od stężenia, ale zaobserwowano wyraźną 12-krotną różnicę między izomerem E a PSS przy 365 nm (IC₅₀(E): 9,23 μM, IC₅₀(365nm): 0,76 μM). Dla porównania, stymulacja światłem związku macierzystego – paroksetyny – nie miała wpływu na jej właściwości farmakologiczne, co potwierdzają porównywalne wartości IC₅₀ dla próbki nienaświetlanej (IC₅₀:365nm: 70 ± 0,03 nM i IC₅₀:NL: 54 ± 0,01 nM).

Aby lepiej zbadać szczegóły molekularne interakcji azo-paroksetyny z SERT, wykorzystano badania elektrofizjologiczne. Rejestrowano prądy skierowane do wewnątrz, wywołane przez serotoninę w konfiguracji whole-cell, aby zbadać kinetyczny profil interakcji azo-paroksetyny z SERT. Dodanie fotoaktywowanej (365 nm) azo-paroksetyny całkowicie zniosło prąd skierowany do wewnątrz (10 μM). Szybkość dysocjacji wyznaczona dla fotoaktywowanej azo-paroksetyny (0,18 ± 0,031; n = 5) była w zakresie innych blokerów SERT, ale znacznie wyższa niż niemodyfikowanej paroksetyny (~0,002 s⁻¹). W przeciwieństwie do tego, E-azo-paroksetyna (10 μM) indukowała jedynie marginalne zablokowanie prądów wywołanych przez serotoninę. Jednak zastosowanie wyższych stężeń (100 μM) uniemożliwiło dalsze pomiary, ponieważ uszczelnienie pipety patch było konsekwentnie tracone. Badacze spekulowali, że E-azo-paroksetyna może wywierać efekty toksyczne przy wyższych stężeniach, jak opisano wcześniej dla paroksetyny. Dlatego przeprowadzili badania toksyczności komórkowej, jednak tylko DMSO miało wpływ przy wyższych stężeniach, natomiast ani azo-paroksetyna, ani azobenzen nie wykazywały toksyczności.

Jak wpływa światło na selektywność leków?

Czy dodanie grupy azo do paroksetyny mogłoby zmienić wzorzec selektywności początkowego związku? Naukowcy zbadali, czy azo-paroksetyna oddziałuje z innymi członkami rodziny transporterów monoamin. Zgodnie z raportowaną selektywnością paroksetyny dla SERT, zaobserwowano 30 i 50-krotnie wyższe wartości IC₅₀ dla DAT i NET. Natomiast interakcje azo-paroksetyny z DAT i NET były porównywalne z siłą hamującą obserwowaną dla SERT.

W przypadku SERT stymulacja światłem spowodowała wyraźne przesunięcie krzywej stężenie-odpowiedź w lewo, z 12-krotnym zmniejszeniem odpowiadającej wartości IC₅₀. W porównaniu z tymi wartościami, interakcja między izomerem E a stanem fotoaktywowanym (365 nm) azo-paroksetyny a ludzkim DAT i NET była znacznie mniej wyraźna. Jednak przełączanie optofarmakologiczne zwiększyło powinowactwo do NET, co zaobserwowano jako około 3-krotne zmniejszenie wartości IC₅₀. W przypadku DAT, wpływ przełączania optycznego na siłę hamowania był jeszcze mniejszy (1,7-krotna różnica).

Co ciekawe, nastąpiła stosunkowo niewielka utrata powinowactwa azo-paroksetyny w porównaniu z macierzystym związkiem paroksetyną w przypadku DAT i NET (tylko utrata o współczynnik ~2 do 5, podczas gdy utrata powinowactwa w przypadku SERT była na poziomie współczynnika 171); jest to zatem względna poprawa powinowactwa przez dodanie azobenzenu.

Czy fotofarmakologia rozszerza horyzonty poza SERT?

Obserwacja, że połączenie paroksetyny z fotoprzełączalną grupą azobenzenu zmniejszyło jej selektywność w stosunku do SERT w porównaniu z DAT i NET, skłoniła badaczy do zbadania profilu interakcji z bardziej odległymi transporterami. Najpierw wybrano innego członka rodziny SLC6 – transporter kwasu gamma-aminomasłowego (GABA; GAT1), który jest celem przeciwpadaczkowego leku tiagabiny. Wychwyt [³H]GABA w komórkach HEK293 stabilnie ekspresjonujących ludzki GAT1 był hamowany przez paroksetynę w sposób zależny od stężenia, dając wartość IC₅₀ ponad 120 μM. Azo-paroksetyna hamowała GAT1 w porównywalnym stopniu i bez różnicy między izomerem E a stanem fotoaktywowanym (365 nm).

Następnie naukowcy sprawdzili, czy to samo dotyczy innego gatunku ssaków; przetestowali szczurzy GAT1 i stwierdzili jeszcze niższe powinowactwo paroksetyny, o wartości około 250 μM. W tym przypadku dodanie azobenzenu poprawiło powinowactwo około dwu- do trzykrotnie; co ciekawe, jednak zaobserwowano niższe powinowactwo przy wyższej zawartości izomeru Z. Na koniec włączono ludzki GAT3, aby rozszerzyć eksperymenty na inny transporter SLC6 z rodziny transporterów GABA. Ponownie, wychwyt GABA był hamowany zarówno przez paroksetynę, jak i azo-paroksetynę, z niewielką utratą powinowactwa widoczną w zwiększonym stanie izomeru Z tego ostatniego związku.

Z tych eksperymentów dotyczących wychwytu za pośrednictwem GAT badacze wywnioskowali, że (i) paroksetyna ma – w najlepszym przypadku – tylko niskie powinowactwo do transporterów GABA włączonych do tego badania oraz (ii) dodanie azobenzenu łagodnie zwiększa to powinowactwo.

Na koniec, zaintrygowani wzrostem powinowactwa w przypadku szczurzego GAT1, badacze sprawdzili, czy sama grupa azobenzenu ma jakiekolwiek powinowactwo do ludzkiego SERT, szczurzego i ludzkiego GAT1 oraz ludzkiego GAT3. Zbadali stężenia do 1 mM najpierw na ludzkim SERT i nie zaobserwowali żadnych znaczących efektów hamujących nawet przy najwyższych testowanych stężeniach, bez wpływu wzbudzenia przy 365 nm. Transportery GABA były nieco bardziej reaktywne na podanie azobenzenu, a w konfiguracji E azobenzen był w stanie hamować do 40% wychwytu GABA. Ludzki GAT3 był jednak dotknięty na jeszcze wyższych poziomach, a komórki HEK293 stabilnie ekspresjonujące GAT3 wykazywały hamowanie ponad 60%. Podczas badania GAT1 gatunku szczura, wartość E-azobenzenu była porównywalna z wartością ludzkiego GAT1.

Jak molekularne dokowanie wyjaśnia różnice między izomerami?

Aby wyjaśnić determinanty molekularne, które rządzą różnicą aktywności E– i Z-azo-paroksetyny, przeprowadzono badania dokowania molekularnego w kieszeni ortostatycznej ludzkiej struktury krystalicznej SERT PDB ID 5I6X. Struktura ta została wybrana, ponieważ była współkrystalizowana z paroksetyną i rozwiązana przy wyższej rozdzielczości niż później opublikowana struktura 6AWN (odpowiednio 3,14 i 3,62 Å). Poprzez dokowanie indukowane w Schrödinger Suite 2018-3, uzyskano 45 poz dla Z-azo-paroksetyny i 38 dla E-azo-paroksetyny.

Wyniki dokowania (wynik glide gscore i glide emodel score) były zgodne z danymi biologicznymi: 19 najwyżej sklasyfikowanych pozycji było zajętych wyłącznie przez pozy Z-azo-paroksetyny, a obliczone średnie wyniki glide i emodel dla wszystkich poz wykazały wyraźną tendencję w kierunku bardziej korzystnych wyników dokowania dla Z-azo-paroksetyny. Pozy były dalej analizowane przez klastrowanie wspólnego rusztowania wspólnej podstruktury paroksetyny i przez obliczenie RMSD w porównaniu ze współkrystalizowaną paroksetyną w ludzkiej strukturze SERT 5I6X.

Najbardziej zaludniony klaster (łącznie 54 pozy, 34 Z-azo-paroksetyny i 20 E-azo-paroksetyny) nie tylko wykazał najmniejszy RMSD w porównaniu ze strukturą krystaliczną (średni RMSD 1,8 ± 0,8), ale także ponownie wykazał wyraźną tendencję lepszych wyników dokowania dla konfiguracji Z. Ponieważ związki azo zawierają szkielet paroksetyny, oczekiwano, że związki te powinny przyjąć podobny tryb wiązania, jak zaobserwowano w strukturze krystalicznej.

W ludzkiej strukturze krystalicznej SERT 5I6X paroksetyna wykazuje charakterystyczne interakcje: w podkieszeni A, kationowy azot paroksetyny tworzy mostek solny i wiązanie wodorowe z D98, a także interakcję kation-pi i wiązanie wodorowe z Y95. Grupa benzodioksolu jest umieszczona w hydrofobowym grzbiecie podkieszeni B utworzonym przez A169, I172, A173 i Y176, i wykazuje interakcję pi-pi z tym ostatnim. Pierścień fluorofenylowy w podkieszeni C skierowany jest w stronę T497 i V501 i tworzy interakcję pi-pi z F341.

Pozy dokowania w najbardziej zaludnionym klastrze wykazały podobne orientacje cech molekularnych podstruktury paroksetyny, podczas gdy dołączony azobenzen musiał rozszerzyć się do przedsionka zewnątrzkomórkowego. Co godne uwagi, Z-azo-paroksetyna może przyjąć tryb wiązania bardziej podobny do paroksetyny w strukturze krystalicznej niż E-azo-paroksetyna, co pokazują niższe średnie wyniki RMSD oraz niższa średnia odległość kationowego azotu do D98 w najbardziej zaludnionym klastrze. D98 tworzy mostek solny z kationowym azotem, który jest znany jako główna interakcja napędzająca powinowactwo wśród transporterów monoamin.

Aby zidentyfikować pozy reprezentujące najbardziej wiarygodne hipotezy wiązania dla E– i Z-azo-paroksetyny, badacze zdefiniowali następujące kryteria wyboru: wybrane pozy są (i) najwyżej sklasyfikowane wśród 15 najlepszych poz według wyniku dokowania emodel, (ii) najwyżej sklasyfikowane wśród 15 najlepszych poz według wyniku dokowania glide gscore, (iii) wykazują wartość RMSD ≤ 1,5 Å do szkieletu paroksetyny w strukturze krystalicznej oraz (iv) tworzą mostek solny między kationowym azotem ligandu a naładowanym bocznym tlenem D98 (odległość ≤ 4,5 Å).

Dla Z-azo-paroksetyny wyodrębniono sześć poz, które spełniają wszystkie kryteria. Co ciekawe, dla E-azo-paroksetyny nie ma ani jednej pozy spełniającej wszystkie kryteria. Dlatego wyodrębniono cztery pozy, które spełniają trzy z czterech kryteriów. Aby ostatecznie wybrać najbardziej obiecujące pozy, przeprowadzono obliczenia MM-GBSA w celu uszeregowania wybranych poz według ich szacowanej energii swobodnej wiązania. Wszystkie wybrane sześć poz Z-azo-paroksetyny wykazało bardziej korzystną szacowaną energię swobodną wiązania niż wybrane cztery pozy E.

Jak fotofarmakologia wpływa na przyszłość terapii zaburzeń neuropsychiatrycznych?

Z-azo-paroksetyna mogła przejść te same interakcje co paroksetyna w strukturze krystalicznej, jednocześnie dostosowując dołączoną grupę azobenzenu w przedsionku zewnątrzkomórkowym. W przeciwieństwie do tego, fragment piperydyny E-azo-paroksetyny musiał się nieznacznie obrócić w kierunku przedsionka zewnątrzkomórkowego, aby umożliwić dostosowanie grupy azobenzenu w przedsionku zewnątrzkomórkowym, co skutkowało zwiększoną odległością do D98 (odpowiednio 4,3 i 5,1 Å) i utratą interakcji z F341.

SERT należy do monoaminowych NTT, regulujących zewnątrzkomórkowe stężenie serotoniny, a tym samym utrzymujących przekaźnictwo serotoninergiczne. Ze względu na dysfunkcje układu serotoninergicznego związane z poważnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi, takimi jak depresja czy lęk, SERT stanowi ważny cel zarówno dla klinicznie istotnych leków, takich jak leki przeciwdepresyjne i przeciwlękowe, jak i dla narkotyków rekreacyjnych. Ponieważ obecnie wprowadzone na rynek leki często wykazują działania niepożądane, potrzebne są nowe leki o wyższej selektywności SERT. Fotofarmakologia umożliwia wysoce precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną związków bioaktywnych, a zatem wykazuje duży potencjał w znacznym zmniejszeniu niepożądanych skutków ubocznych w lekach.

Badania te pokazują, że aktywność SERT może być dość wyłącznie manipulowana przez nowy czynnik optofarmakologiczny azo-paroksetynę w sposób odwracalny, przy niskim prawdopodobieństwie efektów ubocznych związanych ze związkiem. “To potwierdza użyteczność grup azobenzenu, które wydają się nie zmieniać aktywności farmakodynamicznej sprzężonych związków” – konkludują autorzy.

Wyniki te mają istotne implikacje dla przyszłego rozwoju leków. Czy możemy wyobrazić sobie terapie, w których leki są aktywowane tylko w określonych obszarach mózgu poprzez precyzyjne dostarczanie światła? Jakie wyzwania techniczne trzeba pokonać, aby takie podejście mogło zostać zastosowane w praktyce klinicznej? Rozwój fotofarmakologii otwiera fascynujące możliwości dla bardziej precyzyjnego i zindywidualizowanego leczenia zaburzeń neuropsychiatrycznych, potencjalnie z mniejszą liczbą skutków ubocznych i lepszą skutecznością.

Podsumowanie

Fotofarmakologia stanowi innowacyjne podejście w leczeniu zaburzeń psychicznych, wykorzystując światłoczułe związki do precyzyjnej kontroli działania leków. Głównym osiągnięciem jest opracowanie azo-paroksetyny – modyfikacji standardowej paroksetyny poprzez dodanie grupy azobenzenu. Związek ten wykazuje 12-krotną różnicę w aktywności między stanem nieaktywowanym (izomer E) a aktywowanym światłem (izomer Z). Badania potwierdziły skuteczne hamowanie transportera serotoniny (SERT) przez azo-paroksetynę, przy czym forma aktywowana światłem wykazuje znacznie wyższe powinowactwo. Istotnym aspektem jest możliwość odwracalnej kontroli aktywności leku poprzez ekspozycję na światło o określonej długości fali, co może prowadzić do zmniejszenia efektów ubocznych i zwiększenia skuteczności terapii. Wyniki badań sugerują potencjał fotofarmakologii w rozwoju precyzyjnych i spersonalizowanych terapii neuropsychiatrycznych.